SAM 格式与 SAMtools

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1. 背景

SAM 格式出现前，每个比对器各有独特输出格式——MAQ 有 MAP、ELAND 有 ELAND、Bowtie 有自己的格式。跨工具比较或切换需要大量格式转换脚本。SAM（Sequence Alignment/Map）由 Heng Li 等人提出，统一了比对数据的存储标准。

SAM 很快被 1000 Genomes Project 采纳，随后成为全行业标准。其二进制版本 BAM 和压缩版本 CRAM 至今是生物信息学的核心格式。

2. 格式结构

2.1 头部（Header）

以 @ 开头的行：

@HD     VN:1.0  SO:coordinate        // 版本与排序
@SQ     SN:chr1 LN:248956422          // 参考序列
@RG     ID:sample1 SM:NA12750         // 读段组
@PG     ID:bwa PN:bwa VN:0.7.15      // 程序信息

2.2 11 个必填字段

#	字段	类型	说明
1	QNAME	str	读段名称
2	FLAG	int	位标记（配对、链方向等）
3	RNAME	str	参考序列名
4	POS	int	最左端 1-based 坐标
5	MAPQ	int	比对质量（Phred）
6	CIGAR	str	CIGAR（如 35M1D65M）
7	RNEXT	str	配对读段参考名
8	PNEXT	int	配对读段位置
9	TLEN	int	插入片段长度
10	SEQ	str	读段序列
11	QUAL	str	碱基质量（Phred+33）

2.3 FLAG 位标记

值	含义
1	读段已配对
2	所有片段正确比对
4	该片段未比对
8	mate 未比对
16	比对到反向互补链
32	mate 比对了反向互补链
64	该读段是 read 1
128	该读段是 read 2
256	次优比对
2048	补充比对（supplementary）

2.4 CIGAR 操作

操作	说明	消耗参考	消耗读段
M	匹配/错配	✓	✓
I	插入		✓
D	删除	✓
N	跳过（intron）	✓
S	soft clip		✓
H	hard clip

示例：CIGAR="35M1D65M" → 35 匹配 + 1 删除 + 65 匹配。读段长 100bp，参考消耗 101bp。

2.5 TAG 字段

NM:i:3          // 编辑距离（错配 + indel 总数）
AS:i:150        // 比对分数
XS:i:120        // 次优比对分数
RG:Z:sample1    // 读段组
MD:Z:35A0^C65   // 错配和删除的精确位置

3. BAM —— 二进制版本

大小： BAM 约为 SAM 的 1/5–1/10（BGZF 块级压缩）
索引： 建立 .bai 索引后可 O(log n) 时间区域查询
随机访问： 通过 .bai 指数，人类基因组可在毫秒级提取指定基因座的所有比对

4. SAMtools 核心命令

命令	功能
samtools view	查看/转换 SAM/BAM/CRAM
samtools sort	按坐标排序
samtools index	建 .bai 索引
samtools merge	合并 BAM
samtools mpileup	pileup → SNP/indel 检测
samtools flagstat	比对统计
samtools depth	深度计算
samtools tview	文本比对可视化

生态系统核心： GATK、freebayes、STAR、HISAT2 等都支持 SAM/BAM。SAMtools 为这一生态系统提供了基础管道功能。

5. 与 BWA 的关系

BWA 是最早默认输出 SAM 格式的比对器之一。 BWA 论文中的数据分析都基于 SAM 格式。BWA + SAMtools 提供了从比对到变异检测的完整流程。两者由同一作者开发（Heng Li），设计上深度整合。